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Technique Support
技術(shù)應(yīng)用
2020年接近尾聲，突如其來(lái)的一場(chǎng)疫情給人們的生活帶來(lái)巨大影響。中西醫(yī)結(jié)合，中藥與西藥聯(lián)用，在病毒感染引起的新冠肺炎治療，挽救生命，戰(zhàn)勝疫情中發(fā)揮著重要作用。但是因?yàn)橹兴幊煞侄鄻?，與疾病的相互作用非常復(fù)雜，難以分析其有效成分及作用機(jī)制，極大地限制了中藥的廣泛使用。近年來(lái)，隨著生物信息學(xué)和其它分析技術(shù)的進(jìn)展，中藥活性成分表征、鑒定及分子機(jī)制方面的研究和應(yīng)用越來(lái)越多，有望使中藥更加造福于現(xiàn)代醫(yī)療。
作為生命科學(xué)研究最新手段之一的SPR技術(shù)由于其研究分子互作的實(shí)時(shí)性、超高靈敏度、高專一性、可以同時(shí)測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)和解離平衡常數(shù)等特點(diǎn)，已成為藥物研發(fā)全流程和質(zhì)量控制的必需技術(shù)，并被2020版中國(guó)藥典收錄。同樣，在中藥活性成分的表征鑒定、分子靶標(biāo)的篩選、候選藥物分子的改造以及藥物質(zhì)控等方面，SPR也發(fā)揮著非常重要的作用。
- 1. 中藥活性分子直接作用靶點(diǎn)的識(shí)別與確證
蘇木酮A(SA)是從傳統(tǒng)中藥蘇木中分離得到的一個(gè)天然抗炎活性小分子,抗神經(jīng)炎癥效果明確,但是其作用靶點(diǎn)和機(jī)理尚不清楚。北京大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)先將蘇木酮A改造成一個(gè)活性分子探針,從神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞中垂釣到其抗炎靶點(diǎn)蛋白為IMPDH2；然后利用SPR分析確認(rèn)了蘇木酮A與靶點(diǎn)蛋白IMPDH2之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力(KD=3.9 nM)。
2. 天然產(chǎn)物靶向垂釣
基于SPR-MS的垂釣技術(shù)能在分子水平上發(fā)現(xiàn)和鑒定新的天然產(chǎn)物藥物，通過(guò)將“靶點(diǎn)蛋白”固定在芯片表面，當(dāng)被檢測(cè)樣品流過(guò)芯片表面時(shí)，未知的互作因子能夠與“靶點(diǎn)蛋白”相結(jié)合, 實(shí)現(xiàn)對(duì)未知相互作用分子的俘獲，再結(jié)合質(zhì)譜等技術(shù)鑒定出未知因子結(jié)構(gòu)。
第二軍醫(yī)大學(xué)的研究人員以腫瘤壞死因子受體（TNFR）為“捕獲蛋白”，采用SPR垂釣技術(shù)進(jìn)行了5種中藥的篩選和分離，最終從大黃中分離回收得到了TNFR的配體。
3. 先導(dǎo)化合物的優(yōu)化與確認(rèn)
天然產(chǎn)物雷公藤紅素（celastrol ）能夠很好的抑制腫瘤靶點(diǎn)CDC37的活性。研究人員從celastrol的基本結(jié)構(gòu)（三萜）出發(fā)合成了其他的化合物，然后用分子互作技術(shù)測(cè)定了所有化合物與藥物靶點(diǎn)CDC37相互作用；通過(guò)對(duì)其他衍生物的親和力比較，SPR技術(shù)給出了這種天然產(chǎn)物的先導(dǎo)化合物改造路徑，為后續(xù)的藥物開(kāi)發(fā)提供了關(guān)鍵作用。
4. 傳統(tǒng)中藥抗病毒機(jī)制研究
三萜是一類含疏水五環(huán)骨架的植物次生代謝物，通常認(rèn)為是植物防御病原體感染的重要化學(xué)成分，廣泛存在于自然界。為了揭示這類三萜天然產(chǎn)物廣譜抗病毒的作用機(jī)制，北京大學(xué)的研究人員利用SPR技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些三萜物質(zhì)通過(guò)結(jié)合到流感、埃博拉和HIV病毒等I型RNA病毒膜蛋白的HR2結(jié)構(gòu)域，抑制了HR1-HR2三聚體發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)形成，進(jìn)而阻礙了病毒-細(xì)胞膜融合；最終揭示了三萜天然產(chǎn)物廣譜抗病毒的分子機(jī)制。
5. 藥材的質(zhì)量控制
中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物所楊美華研究員帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)利用Au/Fe3O4納米復(fù)合材料為放大標(biāo)簽，借助英柏生物的表面等離子體共振檢測(cè)儀（MI-S200 SPR），實(shí)現(xiàn)了多菌靈農(nóng)藥殘留檢測(cè)的新方法。研究人員設(shè)計(jì)了合理的放大模式，利用MI-S200 SPR檢測(cè)平臺(tái)，檢測(cè)多菌靈的檢測(cè)下限（LOD）為0.44ng·ml?1；對(duì)比酶聯(lián)免疫分析方法，整個(gè)分析方法的靈敏度提高了近1個(gè)數(shù)量級(jí)。利用這種方法檢測(cè)了藥材枸杞，其添加回收率102.4%～115.0%，RSD＜10%，檢測(cè)結(jié)果與UPLC-MS/MS的檢測(cè)結(jié)果完全一致。該研究成果以“A gold/Fe3O4 nanocomposite for use in a surface plasmon resonance immunosensor for carbendazim”為題發(fā)表在Microchimica Acta上 [1]。
最近發(fā)表的兩篇抗新冠病毒中藥化合物篩選的文章，進(jìn)一步顯示了SPR在中藥活性成分鑒定及分子機(jī)制研究方面發(fā)揮的重要作用[2][3]。
1）Chinese herbal compounds against SARS-CoV-2: Puerarin and quercetin impair the binding of viral S-protein to ACE2 receptor
作者利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP），以及分子對(duì)接分析工具，篩選出與ACE2親和力得分高的兩個(gè)分子-葛根素和槲皮素。用SPR分析了它們與ACE2結(jié)合的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。在SPR上作競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們可以顯著抑制病毒S蛋白與ACE2的結(jié)合。
2）Network pharmacology, molecular docking integrated surface plasmon resonance technology reveals the mechanism of Toujie Quwen Granules against coronavirus disease 2019 pneumonia
第一個(gè)用于新冠肺炎的中成藥-透解祛瘟顆粒，可以降低重癥率和死亡率。作者將透解祛瘟顆粒中的所有藥材做了基于SARS-CoV-2病毒靶點(diǎn)的生物信息學(xué)分析。分子對(duì)接結(jié)果顯示其中四個(gè)分子（包括槲皮素）得分高于其它化合物。SPR實(shí)驗(yàn)顯示槲皮素更多地與SARS-CoV-2的S蛋白結(jié)合，而不是與ACE2結(jié)合。
槲皮素與Spike蛋白的SPR實(shí)驗(yàn)，KD=1.69*10e-5M
上述兩篇文章都利用生物信息學(xué)工具篩選出有潛在治療作用的化合物，然后將其與新冠病毒的致病靶點(diǎn)（S蛋白和ACE2）做SPR分析，得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)，第一篇文章還做了基于SPR的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)分子機(jī)制做了一定探討。
值得一提的是，目前已經(jīng)有一項(xiàng)關(guān)于槲皮素磷脂復(fù)合物作為輔助療法治療新冠肺炎患者的臨床II期實(shí)驗(yàn)在巴基斯坦注冊(cè)，目前處于患者招募階段（https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04578158?cond=quercetin&draw=2&rank=1）。
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參考文獻(xiàn)：
- Li Q, Dou X, Zhao X, Zhang L, Luo J, Xing X, Yang M. A gold/Fe3O4 nanocomposite for use in a surface plasmon resonance immunosensor for carbendazim. Mikrochim Acta. 2019 Apr 30;186(5):313. doi: 10.1007/s00604-019-3402-0. PMID: 31041544.
- Pan B, Fang S, Zhang J, Pan Y, Liu H, Wang Y, Li M, Liu L. Chinese herbal compounds against SARS-CoV-2: Puerarin and quercetin impair the binding of viral S-protein to ACE2 receptor. Comput Struct Biotechnol J. 2020;18:3518-3527. doi:10.1016/j.csbj.2020.11.010. Epub 2020 Nov 11. PMID: 33200026; PMCID: PMC7657012.
- Ye M, Luo G, Ye D, She M, Sun N, Lu YJ, Zheng J. Network pharmacology, molecular docking integrated surface plasmon resonance technology reveals the mechanism of Toujie Quwen Granules against coronavirus disease 2019 pneumonia. Phytomedicine. 2020 Oct 28:153401. doi: 10.1016/j.phymed.2020.153401. Epub ahead of print. PMID: 33191068.